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Invitrogen脂質體2000的操作流程及注意事項

發(fā)布時間:2015-01-23瀏覽:2228次

Invitrogen脂質體2000的操作流程及注意事項


Invitrogen脂質體2000的操作流程及注意事項

*,Invitrogen脂質體2000是廣大老師所熟知的轉染試劑,其特點:轉染步驟快速簡便

(1)DNA-陽離子脂質體試劑的復合體可以直接加入到細胞培養(yǎng)基中,有血清也不怕。

(2)轉染后不需要除去Lipofectamine 2000試劑,無需換培養(yǎng)基。

我們介紹一下 Invitrogen脂質體2000的操作流程、注意事項等。

一、操作流程   
事實上Lipofectamine系列產(chǎn)品操作流程都是又快又簡單:稀釋DNA以及Lipofectamine 2000,混合2種稀釋液保溫20分鐘,加入培養(yǎng)細胞中孵育24-96小時檢測結果。下面是Invitrogen提供的詳細流程和注意事項。
1、轉染前一天,胰酶消化細胞并計數(shù),細胞鋪板,使其在轉染日密度為90%。細胞鋪板在0.5ml                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                        含血清,不含抗生素的正常生長的培養(yǎng)基中。
2、對于每孔細胞,使用50μl無血清培養(yǎng)基(如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基)稀釋0.8μg-1.0μg DNA。3、對于每孔細胞,使用50μl OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基稀釋1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000試劑。Lipofectamine 2000稀釋后保溫5分鐘(在30分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。保溫時間過長會降低活性。) 注意:即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀釋,細胞也可以使用D-MEM培養(yǎng)。如果D-MEM做為Lipofectamine 2000的稀釋液,必須在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。
4、混合稀釋的DNA(第2步)和稀釋的Lipofectamine 2000(第3步)。在室溫保溫20分鐘。 注意:溶液可能會混濁,但不會影響轉染。復合物可以在室溫保持6小時穩(wěn)定。
5、直接將復合物加入到每孔中,搖動培養(yǎng)板,輕輕混勻。注意:如果在無血清條件下轉染,使用含血清的正常生長培養(yǎng)基進行細胞鋪板。在加入復合物前移去生長培養(yǎng)基,替換為0.5ml無血清培養(yǎng)基。
6、在37℃,5%的CO2中保溫24-48小時,無須去掉復合物或更換培養(yǎng)基或者在4-5小時后更換生長培養(yǎng)基也不會降低轉染活性。
7、在細胞中加入復合物24-72小時后,分析細胞抽提物或進行原位細胞染色,檢測報告基因活性。這依賴于細胞類型和啟動子活性。對穩(wěn)定表達,在開始轉染一天后將細胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中,兩天后加入篩選抗生素。進行穩(wěn)定表達需要數(shù)天或數(shù)周。
8、對于96孔板培養(yǎng),不再需要提前一天進行細胞鋪板,而可以直接在平板中制備復合物,然后將細胞懸浮液加入到復合物就可以了,這樣進一步減少了轉染時間。這種改進步驟已經(jīng)過293-H,293-F,COS-7L和CHO細胞的試驗,同傳統(tǒng)方法相比活性稍低。快捷的步驟和蛋白表達細胞系的轉染使得Lipofectamine 2000非常適用于96孔板的高通量轉染,比如cDNA文庫的篩選和蛋白瞬時表達。

二、適用細胞株范圍
不同的轉染試劑所適用的細胞株范圍各不相同。一個實驗室常常會用到不止一種細胞株,甚至是比較特殊的細胞株。一個轉染試劑所適用的細胞株越多,當然越受用戶的歡迎。根據(jù)Invotrogen的資料,Lipofectamine 2000已經(jīng)證實可用于高達517種細胞株,覆蓋了相當廣的范圍。要看看Lipofectamine 2000是否適用于你現(xiàn)有的細胞株,可以訪問以下Invitrogen

三、適用的核酸類型和DNA大小    
有的轉染試劑是為siRNA轉染而設計的,有的則是為DNA轉染設計。Lipofectamine 2000可以適用于包括DNA,siRNA, dsRNA, 熒光標記的Oligo, RNA等在內(nèi)的核酸轉染,這使得Lipofectamine 2000適用范圍非常廣泛,無論是基因表達分析的DNA轉染,或者是RNAi,Lipofectamine 2000都能勝任,不需要為不同目的購買不同試劑了。但,zui常用的DNA轉染中有一個DNA大小的問題,太大的質粒不那么好轉。

四、用量
Lipofectamine 2000用的劑量根據(jù)說明書,24孔板轉染每次用2ul左右,1.5ml Lipofectamine 2000大約可做750次24孔板轉染,或者大約150次6孔板轉染。

五、注意事項         
 Lipofectamine 2000
要求細胞鋪板密度較高,以90%-95%為佳,這有助于減少陽離子脂質體細胞毒性造成的影響。Lipofectamine 2000可用于有血清培養(yǎng)基的轉染,并且轉染前后不需要換培養(yǎng)基,使得操作方便了許多,但是要注意制備轉染復合物時要求用無血清培養(yǎng)基稀釋DNA和轉染試劑,因為血清會影響復合物的形成。

復合物形成后是可以加入血清。這里要特別注意檢測所用的無血清培養(yǎng)基是否能和Lipofectamine 2000匹配,比如已知CD293, SFM II, VP-SFM就不行。此外還應該留意,如果研究的基因要求比較長的表達時間,比如細胞周期相關基因,或者時細胞表面蛋白,選擇細胞鋪板密較低的轉染試劑,不適合用 Lipofectamine 2000。                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                 

對于大多數(shù)陽離子脂質體試劑,應優(yōu)化DNA濃度和陽離子脂質體試劑量以得到zui大的轉染效率。DNA和轉染試劑的比例,通常推薦是1:2或者1:3,優(yōu)化可以從0.5-5之間慢慢試。使用小劑量確定的優(yōu)化條件可以用于進行大劑量的轉染,只要根據(jù)培養(yǎng)板表面比例線性增加鋪板細胞的數(shù)目、陽離子脂質體試劑和DNA量就可以了。

還有轉染的時候培養(yǎng)基中不能添加抗生素。抗生素,比如青霉素和鏈霉素,一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性,使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導致轉染效率低。所以,在轉染培養(yǎng)基中不能使用抗生素,甚至在準備轉染前進行細胞鋪板時也要避免使用抗生素。這樣,在轉染前就不必潤洗細胞。對于穩(wěn)定轉染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,因為這些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外,為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長,使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。

陽離子脂質體應該在4度保存,要注意避免多次反復長時間開蓋,因為可能會導致脂質體氧化而影響轉染效率。當然還有要注意質粒的質量,質粒的內(nèi)毒素是轉染的大敵。


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